蛋白酶测定法广泛用于蛋白酶抑制剂的研究和蛋白酶活性的检测。监测各种蛋白酶活性已成为许多生物实验室的常规任务。 一些蛋白酶已被确定为良好的**开发目标。

我们的Amplite 通用荧光蛋白酶活性检测试剂盒是进行常规检测分离蛋白酶或鉴定蛋白质样品中污染蛋白酶的理想选择。该试剂盒使用荧光酪蛋白偶联物，其被证明是广谱蛋白酶（例如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV和弹性蛋白酶）的通用底物。在完整的底物中，酪蛋白用绿色荧光染料严重标记，导致显着的荧光猝灭。蛋白酶催化的水解减轻了其猝灭效应，产生明亮的荧光染料标记的短肽。荧光强度的增加与蛋白酶活性成正比。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。使用FITC滤光片组，可以使用荧光酶标仪在Ex / Em = 490/525 nm下轻松读取其信号。

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产品说明书

方案一：一个96孔板的测定方案

以下说明书仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

概述

准备蛋白酶底物溶液（50μL）

加入底物对照，阳性对照或测试样品（50μL）

孵育0分钟（用于动力学读数）或30分钟-1小时（用于终点读数）

在Ex / Em = 490 / 525nm处监测荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

操作方法

1.准备工作解决方案：

1.1制备蛋白酶底物溶液：在2X测定缓冲液（组分C）中以1：100稀释蛋白酶底物（组分A）。在96孔板中每次测定使用50μL蛋白酶底物溶液。

注意：2X分析缓冲液（组分C）设计用于检测胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV和人白细胞弹性蛋白酶的活性。对于其他蛋白酶，请参阅附录I了解适当的分析缓冲液配方。

1.2胰蛋白酶稀释：在去离子水中以1:50稀释胰蛋白酶（5U /μL，组分B），得到浓度为0.1U /μL。

2.根据说明书中的表1和表2，将步骤1中制备的试剂加入96孔微量培养板中。

3.运行酶促反应：

3.1将50μL蛋白酶底物溶液（来自步骤1.1）加入到测定板中的所有孔中，充分混合试剂。

3.2用Ex / Em = 490 / 525nm的荧光板读数器监测荧光增加。

对于动力学读数：立即开始连续测量荧光强度，每5分钟记录数据30分钟。

终点读数：将反应在所需温度下孵育30至60分钟，避光，测量荧光强度。

方案二：使用纯化酶筛选蛋白酶抑制剂

概述

准备蛋白酶底物溶液（10μL）添加底物对照，阳性对照，载体对照或测试样品（90μL）

孵育0分钟（用于动力学读数）或30分钟-1小时（用于终点读数）

监测Ex的荧光强度 / Em = 490 / 525nm

操作方法

1.准备工作解决方案：

1.1制备1X测定缓冲液：将5mL去离子水加入5mL 2X测定缓冲液（组分C）中。

1.2制备蛋白酶底物溶液：在1X测定缓冲液（来自步骤1.1）中以1:20稀释蛋白酶底物（组分A）。使用10μL/孔的蛋白酶底物溶液用于96孔板。

注意：2X测定缓冲液（组分C）设计用于检测胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV和人白细胞弹性蛋白酶的活性。 对于其他蛋白酶，请参阅附录I了解适当的分析缓冲液配方。

1.3蛋白酶稀释：将蛋白酶在1X测定缓冲液中稀释至浓度为500-1000nM。每个孔需要10μL蛋白酶稀释液。为所有测试样品准备适当的量，并为阳性对照和载体对照孔准备额外的量。

2.根据说明书中的表1和表2，将步骤1中制备的试剂加入96孔微量培养板中。

3.运行酶促反应：

3.1将10μL蛋白酶底物溶液（来自步骤1.2）加入阳性对照（PC），载体对照（VC）和测试样品（TS）的孔中。 充分混合试剂。

3.2用Ex / Em = 490 / 525nm的荧光板读数器监测荧光强度。

对于动力学读数：立即开始连续测量荧光强度，每5分钟记录数据30分钟。

终点读数：将反应在所需温度下孵育30至60分钟，避光。 然后测量荧光强度。