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- 产品名称：Amplite NADH检测试剂盒(比色法)
- 产品货号：12571
- 产品品牌：AAT Bioquest
简单介绍
Amplite NADH检测试剂盒(比色法)
产品描述
Amplite NADH检测试剂盒(比色法)
| 货号 | 15271 | 存储条件 | f/l |
| 规格 | 400 Tests | 价格 | |
| Ex (nm) | 460 | Em (nm) | |
| 分子量 | 溶剂 | ||
| 产品详细介绍 | |||
Amplite NADH检测试剂盒(比色法)是美国AAT Bioquest研发的检测NADH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。 传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短紫外波长使得传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite 比色NADH检测试剂盒为检测NADH提供了一种便捷的方法。 NADH探针是一种生色传感器，在NADH减少时具有460nm的*大吸光度。 NADH探针的吸收与溶液中NADH的浓度成正比。 Amplite 比色NADH分析试剂盒提供灵敏的分析，可在100μL分析体积中检测低至3μM的NADH。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供上等的NADH检测试剂盒。
产品说明书
96孔板检测示例
概述
准备NADH反应混合物（50μL）
加入NADH标准品或测试样品（50μL）
在室温下孵育持续15分钟至2小时
监测460nm处的吸光度
注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个
操作步骤
1.准备NADH储备溶液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。
注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.准备NADH反应混合物：
将1mL NADH探针（组分A）加入4mL NADH测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。
注意：5mL NADH反应混合物用于一个96孔。未使用的NADH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至100μM）：
3.1将100μL的NADH储备溶液（来自步骤1）加入到400μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，以产生200μM（100pmol / L）NADH标准溶液。 注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
3.2取200μL的200μMNADH标准溶液进行1：2连续稀释，得到NADH标准品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM连续稀释液。
3.3如表1和2所述，将NADH标准品和含有NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。
注意：根据需要制备细胞或组织样品。
表1白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局
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BL |
BL |
TS |
TS |
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NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
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NS2 |
NS2 |
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NS3 |
NS3 |
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NS4 |
NS4 |
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NS5 |
NS5 |
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NS6 |
NS6 |
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NS7 |
NS7 |
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注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。
表2每个孔的试剂组成
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NADH Standard |
Blank Control |
Test Sample |
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Serial Dilutions*: 50 μL |
PBS: 50 μL |
50 μL |
*注意：将连续稀释的NADH标准品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。
4.在上清液反应中运行NADH测定：
4.1将50μL的NADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADH测定体积为100μL/孔
注意1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。
注意2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。（详见附录）。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。
数据分析
空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。
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图1。 使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices），在96孔白色/透明底板中用Amplite ™比色NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 孵育30分钟（n = 3）可以检测到低至3μM的NADH，在460nm处测量吸光度。
附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂
1.植物细胞样品：
用裂解缓冲液以200mg / mL均化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。
2.**样品：
离心收集**细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟， 用上清液进行试验。
3.哺乳动物细胞样本：
从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。
4.组织样品：
称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。