酪酰胺信号放大（TSA）已被证明是一种特别通用且功能强大的酶放大技术，具有更高的测定灵敏度

AF546 酪胺

对于许多**组织化学（IHC）应用，传统的酶促扩增程序足以实现足够的抗原检测。但是，有几个因素限制了这些过程的敏感性和实用性。酪酰胺信号放大（TSA）已被证明是一种特别通用且功能强大的酶放大技术，具有更高的测定灵敏度。 TSA基于HRP在低浓度过氧化氢存在下将标记的含酪胺底物转化为可与HRP或附近的酪氨酸残基共价结合的氧化的高反应性自由基的能力。为了实现*大程度的IHC检测，酪胺预先标记有荧光团。通过每个过氧化物酶标记的多个酪酰胺底物的更新而产生的信号放大可转化为低丰度靶标的超灵敏检测以及使用更少量的抗体和杂交探针。在**组织化学应用中，源自TSA方法的灵敏度增强功能可以增加一抗稀释度以减少非特异性背景信号，并可以克服由次优固定程序或目标表达水平低引起的弱**标记。 AF546酪酰胺包含明亮的AlexaFluor®546，可使用标准TRITC滤波片（AlexaFluor®是ThermoFisher的商标）轻松检测出。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供*上等的AF546 酪胺。

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产品说明书

样品实验方案

简要概述

1. 修复/透化/阻断细胞或组织
2. 在封闭缓冲液中添加一抗
3. 添加结合HRP的二抗
4. 准备酪酰胺工作溶液，并在室温下在细胞或组织中涂抹5-10分钟

溶液配制

储备溶液配制

酪胺储备溶液（200X）：向小瓶中加入100 µL DMSO，并充分混合。 注意：未使用的酪胺储备溶液可在2-8℃下储存。

工作溶液配制

酪胺工作溶液（1倍）：将100 µL的酪胺储备溶液添加到包含0.003％H₂O₂的20 mL缓冲液中。注意：可以使用pH = 7.4的Tris Buffer以获得*佳性能。注意：应立即使用酪胺工作溶液。 注意：20 mL溶液适合200次测试。

实验步骤

（该步骤适用于细胞或组织染色）

细胞固定和透化

1.在室温下用3.7％甲醛或低聚甲醛的PBS固定细胞或组织20分钟。

2.用PBS冲洗细胞或组织两次。

3.在室温下用0.1％Triton X-100溶液透化细胞1-5分钟。

4.用PBS冲洗细胞或组织两次。

组织固定，脱石蜡和补液

（根据标准IHC方案对组织进行脱蜡和脱水处理。根据实验方案使用特定溶液进行抗原修复。）

过氧化物酶标记

1.可选：通过在过氧化物酶淬灭溶液（例如3％过氧化氢）中孵育细胞或组织样品10分钟来淬灭内源性过氧化物酶活性，然后在室温下用PBS冲洗两次。

2.可选：如果使用结合HRP的链霉亲和素，建议通过生物素封闭缓冲液封闭内源性生物素。

3.在4°C下用封闭溶液（例如含1％BSA的PBS）封闭30分钟。

4.除去封闭溶液，并添加稀释好的一抗，在室温下放置60分钟或在4°C下放置过夜。

5.用PBS洗涤3次，每次5分钟。

6.将100 µL二级抗体-HRP工作溶液添加到每个样品中，并在室温下孵育60分钟。注意：孵育时间和浓度可以根据信号强度而变化。

7.用PBS洗涤3次，每次5分钟。

Styramide标记

1.向每个样品中添加100 µL Styramide 工作溶液，并在室温下孵育5-10分钟。 注意：如果您观察到非特异性信号，则可以缩短Styramide的孵育时间。您应该在不同的孵育时间点使用阳性和阴性对照确定样品的*佳孵育时间，或者您可以在工作溶液中使用较低浓度的Styramide。

2.用PBS冲洗3次。

复染和荧光成像

1.根据需要对细胞或组织样本进行复染。AAT提供了一系列核复染色试剂，如表1所示。请按照试剂附带的说明进行操作。

2.加上盖玻片。

3.使用适当的滤波器观察Styramide的荧光信号。

表1.建议用于核复染色的产品。