通过这种荧光测定GPx测定，我们能够在155μL反应体积中检测低至1.2 mU / mL的GPx。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供上等的Amplite 荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒。

Amplite 荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 红色荧光

        Amplite 荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 红色荧光 是美国AAT Bioquest生产的检测谷胱甘肽过氧化物酶的试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）是具有过氧化物酶活性的酶家族，以保护生物体免受氧化损伤。GPx在将有机氢过氧化物（例如脂质氢过氧化物）还原成其相应的醇或将游离过氧化氢还原成水。因此，它可以防止细胞膜和细胞中其他氧化剂敏感位点的氧化损伤。现在科研已经注意到，改变GPx水平与由许多评论和复杂**引起的损伤相关。在生物样品中测量GPx水平，作为潜在**癌症，糖尿病，神经退行性**和心血管**的潜在指标。AAT Bioquest的荧光谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒提供灵敏的荧光测定法，用于测量生物样品中的GPx水平。该测定基于GPx催化的谷胱甘肽（GSH）氧化成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。生成的GSSG通过谷胱甘肽还原酶（GR）和NADPH再循环至还原态GSH：

R-O-O-H + 2GSH     ^GPx             R-O-H + GSSG + H₂O

GSSG + NADPH + H^{+        GR}           2GSH + NADP⁺

        产品NADP +可以使用我们新开发的专有NADP传感器Quest Fluor™NADP Probe进行专门监控。 NADP传感器仅与NADP反应产生荧光产物。 荧光信号可以用荧光酶标仪在Ex / Em = 420 / 480nm处测量，其与GPx活性成正比。与测量NADPH在340 nm处吸光度降低的其他商业试剂盒相比，我们的Quest Fluor™NADP探针可用于直接量化NADP水平。通过这种荧光测定GPx测定，我们能够在155μL反应体积中检测低至1.2 mU / mL的GPx。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供上等的Amplite 荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒。 

产品说明书

96孔板的测定方案

概述

准备GPx分析混合物（50μL）

添加GPx标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育30分钟

加入20μLQuestFluor™NADP探针

添加20μLNAP检测溶液

在室温下孵育10-20分钟

添加15μL增强剂

溶液在室温孵育30-60分钟，在Ex / Em = 420 / 480nm处记录荧光

注意1.为了获得*佳效果，强烈建议使用黑色版。

注意2.在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分的一个小瓶。

操作方法

1.制备谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）标准储备液：

将50μLddH2O或1×PBS缓冲液加入到GPx标准品（组分A）的小瓶中，制成10U / mL标准储备溶液。

注意：未使用的GPx标准储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20ºC。

2.准备GPx标准的系列稀释液：

2.1将4μLGPx标准储备溶液（10U / mL，来自步骤1）加入996L 1×PBS缓冲液中，以产生浓度为40mU / mL的标准溶液。

注意：稀释的GPx标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

2.2取200μL40mU / mL GPx标准溶液进行1：2连续稀释，得到大约20,10,5,2.5,1.25,0.625和0 mU / mL的GPx标准品系列稀释液。

2.3如表1和2中所述，将GPx标准品和含有GPx的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

表1实心黑色96孔微孔板中GPx标准品和测试样品的布局

注意：GP = GPx标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

表2每个孔的试剂组成

*注意：将连续稀释的GPx标准品从大约0.6 mU / mL加到40 mU / mL，一式两份加入GP1到GP7的孔中。

3.准备GSH原液（100X）：

将100μlddH2 O加入到GSH小瓶（组分D）中以制备100X GSH储备溶液。

4.准备GPx底物储备液（100X）：

将100μlddH2O加入到基质小瓶（组分E）中以制备100X底物储备溶液。

5.准备GPx分析混合物：

5.1将5 mL测定缓冲液（组分B）加入一瓶酶混合物（组分C）中。

5.2将50μLGSH储备溶液（来自步骤3的组分D），50μL底物储备溶液（组分E，来自步骤4）加入到组分B + C的瓶子中（来自步骤5.1），并充分混合以进行GPx测定 混合物（组分B + C + D + E）。

注1：该GPx测定混合物足以用于一个96孔板。 它不稳定，请及时使用。

注2：不建议储存未使用的GPx分析混合物。 可以将未使用的组分B + C混合物（来自步骤5.1）分成单次使用的等分试样并储存在-20ºC，尽管灵敏度可能会降低。

注3; 将未使用的100X GSH储备溶液（来自步骤3）和100X GPx底物储备溶液（来自步骤4）分成单次使用的等分试样并储存在-20ºC。

6.运行GPx分析：

6.1将50μLGPx测定混合物（来自步骤5.2）加入到GPx标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤2.3），使总体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLGPx测定混合物。

6.2在室温下孵育反应30分钟，避光。

7.运行NADP测定：

7.1将20μLQuestFluor™NADP探针（组分F）加入到GPx标准品，空白对照品和测试样品的每个孔中，充分混合。

7.2在每个孔中加入20μLNAP检测溶液（组分G），充分混匀。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和10μLQuestFluor™NADP探针（组分F）和10μLNAP检测溶液（组分G）。

7.3在室温下孵育反应10-20分钟，避光。

7.4向每个孔中加入15μL增强剂（组分H），使总测定体积为155μL/孔，并在室温下孵育30-60分钟，避光。

注意：对于384孔板，添加7.5μL增强剂。

7.5使用荧光读板仪在Ex / Em = 420/480 nm处监测荧光增加。