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- 产品名称:显色法NADP/NADPH检测试剂盒
- 产品货号:15260
- 产品品牌:AAT Bioquest
简单介绍
金畔生物优异你看的见: (一)、AAT Bioquest中国**战略合作伙伴金畔生物——生物光谱技术的***,每周都有发货补充,货期短到您意想不到,满足客户的需求就是我们的宗旨,只要您下单,我们就能保证您在短期内收到所需产品。 (二)、新一代荧光染料分子与目标分子严格定量,光信号稳定,能非常准确地反映目标分子的真实情况。
产品描述
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)
货号 | 15260 | 存储条件 | f/l |
规格 | 400 Tests | ||
Ex (nm) | 575 | Em (nm) | |
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)是AAT Bioquest研发的检测NADP+/NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。NADP用于合成代谢生物反应,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。该方法具有低灵敏度和高干扰,因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。
Amplite™比色总NADP和NADPH检测试剂盒为敏感检测NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH,其显着提高了检测灵敏度。 此外,该测定具有非常低的背景,因为其在较长波长范围内运行,这显著降低了来自生物样品的干扰。 该实验证明了高灵敏度和低干扰。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供上等的Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒。
Amplite™比色总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析,可在100μL分析体积(100 nM)内检测少至10皮摩尔的NADP(H)。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行,并且容易适应自动化而无需分离步骤。 其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取,以提高测定灵敏度。 如果需要更高的灵敏度,建议使用Cat#15259或15264。
产品说明书
96孔板测定示例
概述
准备NADP / NADPH反应混合物(50μL)
加入NADPH标准品或测试样品(50μL)
在室温下孵育15分钟–2小时
监测575±5nm处的吸光度强度
注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作方法
1.准备NADPH原液:
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。
注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.制备NADP / NADPH反应混合物:
将10mL NADP / NADPH传感器缓冲液(组分B)加入NADP / NADPH再循环酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。
注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADP / NADPH混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADPH标准品的连续稀释液(0至10μM):
3.1将10μLNADPH储备溶液(来自步骤1)加入990L PBS缓冲液中以产生10M(10pmol / L)NADPH标准溶液。
注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。
3.2取200μL10μMNADPH标准溶液进行1:3连续稀释,得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM连续稀释液。
3.3如表1和表2所述,将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中
注意:根据需要准备细胞或组织样本。
表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH标准品和测试样品的布局
BL |
BL |
TS |
TS |
NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
NS2 |
NS2 |
|
|
NS3 |
NS3 |
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|
NS4 |
NS4 |
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NS5 |
NS5 |
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NS6 |
NS6 |
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|
NS7 |
NS7 |
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注意:NS = NADPH标准,BL =空白对照,TS =测试样品。
表2.每个孔的试剂组成
NADPH Standard |
Blank Control |
Test Sample |
Serial Dilutions*: 50 μL |
PBS: 50 μL |
50 μL |
注意:将连续稀释的NADPH标准品从0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADPH(例如,>100μM,*终浓度)可能由于NADPH传感器的过度氧化而导致信号降低。
4.在上清液中运行NADP / NADPH测定:
4.1将50μLNADPH反应混合物(来自步骤2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总NADPH测定体积为100μL/孔。
注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。
4.3用吸光度读数仪在575±5 nm或~570 nm至~605 nm的吸光度比下观察吸光度的增加,以提高检测灵敏度。
注意1:对于NADP / NADPH比率测量,建议使用试剂盒15263。
注意2:对于基于细胞的NADP / NADPH测量,建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *(Cat#20012)裂解细胞。
数据分析
空白孔中的吸光度(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从NADPH反应孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。
注意:吸光度背景随时间增加,因此减去每个数据点的空白孔的吸光度非常重要。
图1.使用NOVOStar酶标仪(BMG Labtech),在白色/透明底96孔板中用Amplite™比色总NADP和NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。 在孵育1小时(n = 3)时可以检测到低至100nM(10pmol /孔)的NADPH,而NADH没有响应。