化学发光底物被广泛使用是因为其具有其他检测方法不具备的优点，这些优点使得化学发光成为大多数蛋白实验室首选的检测方法。使用化学发光可以通过多次曝光获得最好的成像结果。还可以将检测试剂完全去除，再对其他目的蛋白进行检测并成像，或对检测条件进行优化。具有很宽的线性响应范围，从而可以检测并定量很宽浓度范围的蛋白质。最重要的是，化学发光在所有的检测方法中具有最高的灵敏度。使用辣根过氧化物酶标记的抗体和Thermo ScientificSuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate(Product # 34095)，可以检测的下限为1飞克，而这得益于这种底物中的增强剂可以很大程度地增强发光强度并增加发光持续时间。

        化学发光底物与其他底物不同之处在于只有在酶和底物发生反应的时候才会产生瞬时的可被检测的光。这与那些可产生稳定有颜色产物的底物不同；些有颜色的沉淀在酶-底物反应结束之后仍然存在于膜上。在化学发光免疫印迹中，底物是反应限制试剂。一旦其耗尽，光就会逐渐变弱并消失。实验中一定要使用适当稀释浓度的抗体，这样才会在几小时内产生稳定的光信号输出，从而维持蛋白检测的一致性和灵敏度。当抗体没被足够稀释时，永远不会获得稳定的光信号输出。系统中太多的酶会快速氧化底物并终止信号。