NADP/NADPH比率检测试剂盒（荧光法） 红色荧光

Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒（荧光法） 红色荧光

        Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒（荧光法）红色荧光是美国AAT Bioquest研发的检测NADP/NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。 NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。

        传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。 这些方法具有低灵敏度和高干扰，因为测定是在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行的。 基于吸收的NADP / NADPH测定的低灵敏度使得测定难以自动化以进行通常使用小样品量的高通量筛选。

        这种Amplite 荧光NADP / NADPH比率检测试剂盒为敏感检测NADP，NADPH及其比例提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶再循环反应中的NADP / NADPH，其显着提高了检测灵敏度。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显着降低了样品干扰。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可以通过荧光酶标仪在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（*大Ex / Em = 540 / 590nm）或吸光度酶标仪在~576nm处容易地读取。 这也提供NADP，NADPH提取缓冲液和细胞裂解缓冲液。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供上等的NADP/NADPH检测试剂盒。 

产品说明书

96孔板检测示例

概述

准备NADPH标准品或测试样品（25μL）

在室温下加入25μLNADPH或NADP提取液孵育15分钟

加入25μLNADP或NADPH提取液（25μL）

加入NADP / NADPH反应混合物（75μL）孵育于 室温保持15分钟 –  2小时

监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作步骤

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.制备NADP / NADPH反应混合物：

将10mL NADPH传感器缓冲液（组分B）加入NADP / NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至10μM）：

3.1将10μL1mMNADPH储备溶液（来自步骤1）加入990μLPBS缓冲液（pH7.4）中，得到10μM（10pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10M NADPH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：3连续稀释，得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0 M系列稀释液。

3.3如表1和2中所述，将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见，NADP / NADPH裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞。

表1.实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NADP / NADPH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS（NADPH）=用NADPH提取液处理10至15分钟的测试样品，然后用NADP提取溶液中和; TS（NADP）=用NADP提取溶液处理10至15分钟的测试样品，然后用NADPH提取溶液中和。

表2每个孔的试剂组成

*注意：将连续稀释的NADPH标准品（0.01μM至3μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADPH（例如，>100μM，*终浓度）可能由于NADPH传感器（对非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

3.4对于NADPH提取（NADPH）：将25μLNADPH提取溶液（组分D）加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μL的NADP提取溶液（组分E）以中和NADPH提取物，如表1和2中所述。

对于NADP提取（NADP）：将25μLNAP提取溶液（组分E）加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNADPH提取溶液（组分D）以中和NADP提取物，如表1和2中所述。

对于总NAPD和NADPH：将25μLNADP/ NADPH对照溶液（组分F）加入NADPH标准品的孔和含有NADP / NADPH的测试样品中。在室温下孵育10至15分钟，然后如表1和2中所述添加25μL对照溶液（组分F）。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。 NADP / NADPH裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞。

4.在上清液反应中运行NADP / NADPH测定：

4.1将75μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.4）的每个孔中，以使总NADPH测定体积为150μL/孔。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

数据分析

        空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。 典型数据如图1所示（总NADP和NADPH对比NADP或NADPH提取物）。

图1.使用Gemini酶标仪（Molecular Devices），在96孔黑色板中用Amplite 荧光NADP / NADPH比率测定试剂盒测量总NADPH和NADP及其提取物剂量响应。 用或不用NADPH或NADP提取溶液处理25μL等量的NADP和NADPH 15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。 在加入75μLNADPH反应混合物后30分钟，在Ex / Em = 540 / 590nm（在570nm处截止）获得信号。 从具有NADPH反应的那些孔的值中减去空白信号（注意：荧光背景随时间增加，因此重要的是减去每个数据点的空白孔的荧光强度值）。