钙的测定对于许多生物学研究来说非常关键。在与Ca2+结合条件下，荧光探针显现出光谱响应，这使研究者可以通过利用荧光显微镜、流式细胞仪、荧光分光镜和荧光分光仪等来研究细胞内部游离的Ca2+浓度的变化。

钙离子荧光探针Fluo-3, AM

        钙离子荧光探针Fluo-3, AM是美国AAT生产的用于钙通量测定的试剂，钙通量测定是用于筛选G蛋白偶联受体（GPCR）的优选方法。 我们的Quest Fluo-8 和Rhod-4 系列钙检测试剂是*亮的绿色和红色钙指示剂。 我们的其他钙指标如Fluo-3，Fura-2，Indo-1，Rhod-5N和Rhod-2 AM也具有与市场上相比高的质量。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供上等的钙离子荧光探针。

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产品说明书

操作步骤

1.使用钙指示剂AM Esters加载细胞：

        AM酯是非极性酯，易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。 AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针加载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）溶解。 DMSO储备溶液应在-20°C下干燥储存并避光。 在这些条件下，AM酯可以稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。 该方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯原液。

b）在实验当天，将钙指示剂溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。使用0.02％Pluronic®F-127在缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）中制备1至10μM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的*终浓度为4-5 uM。细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用较小浓度来达到*佳信号强度。

c）如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可以在细胞培养基中加入丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以减少脱酯化指标的泄漏。在室温或37°C下用钙指示剂酯孵育细胞20分钟至1小时。

d）在HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如2.5mM丙磺舒）中洗涤细胞1-2次以除去过量的探针。

e）在所需的Ex / Em波长下进行实验。

2.测量细胞内钙响应：

        为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用等式：[Ca]_free = K_d[F – F_min]/F_max – F]

        其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。 解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca²⁺结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显著。细胞内指标的原位校准通常产生高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素中将加载的细胞放入Ca²⁺缓冲液中进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂于细胞外培养基进行Ca²⁺水平调控。 说明书中的表1列出了一些钙试剂的Kd值供您参考。