钙离子荧光探针Fluo-8®, AM是美国AAT Bioquest生产的用于钙通量测定的试剂，钙通量测定是用于筛选G蛋白偶联受体（GPCR）的**发现中的优选方法。 我们的Quest Fluo-8®和Rhod-4 系列钙检测试剂是*亮的绿色和红色钙指示剂。 我们的其他钙指标如Fluo-3，Fura-2，Indo-1，Rhod-5N和Rhod-2 AM也具有与市场上相比*高的质量，金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供*上等的钙离子荧光探针。

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产品光谱图

产品说明书

操作步骤

1.使用钙指示剂AM Esters加载细胞：

        AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。 AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。 但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。 它们应在使用前用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）重新配制。 DMSO储备溶液应在-20°C下干燥储存并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定数月。

        以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该方案仅提供指南，实际情况应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯原液。

b）在实验当天，将钙指示剂溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。使用0.02％Pluronic®F-127在您选择的缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）中制备1至10μM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的*终浓度为4-5 uM。 细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。 为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用可产生足够信号强度的*小探针浓度。

注意：非离子洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加钙指示剂AM酯的水溶性。

c）如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可以在细胞培养基中加入丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以减少脱酯化指标的泄漏。 在室温或37°C下用钙指示剂酯孵育细胞20分钟至1小时。

d）在HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如2.5mM丙磺舒，如果适用）中洗涤细胞1-2次以除去过量的探针。

e）在所需的Ex / Em波长下进行实验（见说明书中的表1）。

2.测量细胞内钙响应：

        为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：[Ca]_free = K_d[F – F_min]/F_max – F]

        其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。 解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca²⁺结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca²⁺缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca²⁺水平。 说明书中的表1列出了一些钙试剂的Kd值供您参考。

图示

将U2OS细胞以40,000个细胞/100μL/孔接种过夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。 除去生长培养基，将细胞分别与100μLFluo-3 AM，Fluo-4 AM和Fluo-8 AM在HHBS中以4μM浓度在37℃，5％CO 2中温育。 孵化器1小时。 用200μLHHBS洗涤细胞两次，然后使用FITC通道用荧光显微镜（Olympus IX71）成像。

Fluo-8活细胞方案（点击查看）