Annexin V-iFluor 647标记
| 货号 |
20074 |
存储条件 |
f/l |
| 规格 |
100 tests |
价格 |
|
| Ex (nm) |
656 |
Em (nm) |
670 |
| 分子量 |
~36000 |
溶剂 |
Water |
| 产品详细介绍 |
Annexin V-iFluor 647标记是美国AAT Bioquest研发的用于检测细胞功能的探针，膜联蛋白是钙依赖性磷脂结合蛋白家族。 它们富含真核生物，属于参与信号转导的普遍存在的细胞质蛋白家族。 膜联蛋白V的优先结合配偶体是磷脂酰丝氨酸（PS），其通常保持在细胞膜的内叶（细胞质侧）。 在细胞凋亡中，PS被转移到质膜的外部小叶。 磷脂酰丝氨酸在细胞表面上的出现是细胞凋亡的初始/中间阶段的通用指示，并且可以在观察到形态变化之前检测到。 我们的膜联蛋白V结合物是一组监测细胞功能的工具，旨在通过测量磷脂酰丝氨酸的易位来监测细胞凋亡。
膜联蛋白V结合物在Ca2+存在下与凋亡细胞表面上的PS结合，它也可以通过坏死细胞膜或死细胞并与细胞内部的PS结合。 因此，我们建议将细胞不可渗透的核染色与膜联蛋白V结合物结合使用，以区分死细胞和凋亡细胞。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供上等的Annexin V-iFluor 647检测试剂。
产品说明书
分析方案
概述
用测试化合物（200μL/样品）制备细胞
添加Annexin V结合物测定溶液
室温孵育30-60分钟
用流式细胞仪或荧光显微镜分析
1.用膜联蛋白V缀合物制备和孵育细胞：
1.1制备膜联蛋白V结合测定缓冲液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。
1.2用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。
1.3离心细胞，得到1-5×105个细胞/管。
1.4将细胞重悬于200μL膜联蛋白V结合测定缓冲液中（来自步骤1.1）。
1.5在细胞中加入2μL膜联蛋白V结合物。
可选：在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭，用于坏死细胞。
1.6在室温下孵育30至60分钟，避光。
1.7在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μL膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）以增加体积（参见下面的步骤1.8）。
1.8使用流式细胞仪或荧光显微镜监测荧光强度（参见下面的步骤2或3）。
2.使用流式细胞仪分析：
通过使用具有适当过滤器的流式细胞仪来量化膜联蛋白V缀合物。
注意：粘附细胞上的膜联蛋白V结合流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。 然而，Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。 和van Engelend等人（见参考文献1和2）。
3.使用荧光显微镜分析：
3.1移取步骤1.6的细胞悬液，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，然后用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）重悬细胞。 将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。
注意：对于粘附细胞，建议直接在盖玻片上生长细胞。 与膜联蛋白V缀合物孵育（步骤1.6）后，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，并将膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。 在与膜联蛋白V缀合物孵育后，细胞也可以在2％甲醛中固定，并在显微镜下观察。
3.2在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白V缀合物的凋亡细胞
数据分析
下图是使用流式细胞仪检测膜联蛋白V-mFluor Violet 450与磷脂酰丝氨酸在Jurkat细胞凋亡中的结合活性的实例。 在活的非凋亡细胞中，膜联蛋白V-mFluor Violet 450检测非诱导细胞中的先天性细胞凋亡，其通常为所有细胞的2-6％。 在凋亡细胞中，膜联蛋白V-mFluor Violet 450与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的外部小叶上，导致染色强度增加。
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图1.在Jurkat细胞中检测膜联蛋白VmFluor Violet 450和磷脂酰丝氨酸的结合活性。 将Jurkat细胞在37℃，5％CO2培养箱中不用（蓝色）或用1μM星形孢菌素（红色）处理5小时，然后用Annexin V-mFluor Violet 450染色30分钟。 使用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）流式细胞仪，使用紫外激光在Ex / Em = 405 / 450nm下测量膜联蛋白V-mFluor Violet 450的荧光强度。
