irus Label IT®——高效、一步法用于体内和体外核酸标记的新技术
细胞转染在科学研究中扮演着十分重要的角色，但也是最容易被忽略的一环。转染效率的高低不仅影响实验结果，甚至可能导致得到的实验结果是无效的。在多种类型核酸的细胞转染实验中，研究者们常需要进一步优化转染条件以达到最优的转染效率，特别是较难转染的细胞，而针对特定细胞类型选择对应专业化的转染试剂只是迈向转染实验成功的第一步。
成立于1995年的Mirus Bio，专注及深耕核酸递转领域多年，从最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP级别、可用于AAV和LV生产的TransIT-VirusGEN® (产品年鉴请见图1)。直至文稿发布时，使用Mirus产品发表文章已超过1万篇，并且发表文章及Mirus数据库涵盖了超过1200种细胞类型。
图1 Mirus产品年鉴
在细胞转染实验中，研究者们常常会忽略转染效率/成功率的评估，那么是否有对应技术或者方法允许实时监测DNA/RNA的成功递送以及细胞内的分布状态呢？Mirus Bio Label IT® 核酸标记试剂盒为广大的科研工作者提供了一个方向。Label IT® 核酸标记试剂盒可对任何类型核酸，进行高效、直接的标记，并且为on-step的实验操作。基于非酶反应的标记方法，在不损伤核酸完整性、不影响基因表达的前提下，将选择的标记 (荧光、生物素、地高辛等)以共价的方式连接到核酸上。
Label IT® 试剂盒有多种标签可供选择，包括 Cy®3、Cy®5、CX-罗丹明、TM-罗丹明、荧光素、MFP488、地高辛、生物素和二硝基苯基(DNP)。Label IT® 核酸修饰试剂盒（胺）也可用于基于胺的功能基团进行DNA或RNA修饰。产品特点如下：
- 可用于标记任何DNA或RNA模板——适用于多种应用 (In vitro & in vivo)，如Crispr基因编辑、核酸递转、RNA干扰/表达实验、FISH、Microarray等；
- 一步法标记——简单、轻松即可完成稳定的模版标记反应；
- 可根据实验需求或应用，调节标记的密度——以获得最佳检测标记 DNA 或RNA 的灵敏度；
- 基于共价化学反应——对核酸残基的修饰为永久性、无损伤的，是多种科研应用的理想选择。
绝大多数基于分子和生物学的In vitro 及 in vivo研究都依赖于核酸的标记或标签，理想情况下，此类标记或标签不会影响核酸功能以及研究结果。因此，也发展出来多种核酸标记方式，大致可以归为以下两类：
– 化学标记法：基于结合核酸的反应基团，比如Mirus Label IT® 核酸标记试剂盒属于此类，并且整个反应过程并不需要酶的参与。
Label IT® 化学标记试剂由三个部分组成（如图2）：
(1) 标签/标记 (绿色区域)；
(2) Linker，与核酸进行静电相互作用 (黄色区域)；
(3) Label IT® 试剂以共价形式连接到核酸中活性杂原子的烷基化基团(蓝色区域)。
图2. Label IT®标记分子示意图
– 基于酶反应标记法：通过酶促反应，在该反应过程中加入标记修饰的核酸。
当待研究的核酸加入标记后，可通过以下两种方式进行检测：
– 直接检测：这时，标记的核酸中包含了可用于光学、发光或产生荧光信号的报告分子。
– 间接检测：标记的核酸带有标签或标记，该标记需要特异性的结合报告偶联分子，如生物素结合带有荧光标记的链霉亲和素，地高辛结合带有荧光标记的特异性抗体等。
- Label IT® 核酸标记试剂盒——不改变核酸结构功能
基因沉默相关功能研究在分子和细胞生物学中发挥着重要作用，化学转染也在该研究领域扮演者重要角色。小干扰 RNA (Small interfering RNAs, siRNA)，常作为研究各种类型细胞中蛋白功能核酸类型，通过有效的knockdown从而影响基因表达。那么，加入Label IT®标记的核酸，是否会改变核酸结构，从而影响到后续实验结果呢？
评估测试使用Label IT® siRNA Tracker™ 试剂盒，将相同siRNA加入不同标记 (CyTM3, CyTM5, 荧光素, CX-罗丹明 )以及没有标记siRNA，转染后，可通过荧光显微镜观察到带有标记的siRNA。基因表达结果显示，带有不同标记的siRNA，其目的基因表达水平近似，意味着加入Label IT®标记的核酸，并不影响目的基因表达及功能 (图3)。
图3 Label IT® siRNA Tracker™ 试剂盒评估测试
- Label IT® 核酸标记试剂盒——前沿应用举例
应用一：使用Label IT®技术，富集CRISPR’d细胞
Nasri 和 Mir 等人在文章中阐述了如何通过 Label IT® 技术，富集 CRISPR/Cas编辑成功的细胞。基因组编辑实验面临的挑战之一是如何从未编辑的细胞中成功的筛选/富集出成功编辑的细胞，特别当未被编辑的细胞相对于成功编辑的细胞，具有生长/增殖优势，使得细胞筛选变得更加困难。
为了高效的区分经过基因编辑及未编辑的细胞，作者在CRISPR引导RNA ( gRNA) 与 Cas9 形成复合物及转染细胞前，使用Label IT®对gRNA进行了荧光标记，实验流程示意图如下：
研究结果表明，使用Label IT®标记的gRNA 不会影响基因编辑效率，并且可通过荧光分选/富集成功编辑的细胞群。进一步地，研究者们将该 CRISPR 实验流程应用于针对多种细胞类型的GADD45B基因编辑实验。根据细胞类型的不同，经过Label IT®标记的细胞亚群中，其成功编辑细胞占比相对于总细胞群体提了15-40%。
发表文章信息：
标题: Fluorescent labeling of CRISPR/Cas9 RNP for gene knockout in HSPCs and iPSCs reveals an essential role for GADD45b in stress response
作者: Masoud Nasri, Perihan Mir et al.
杂志: Blood Adv, Volume 3(1), Jan 2019.
DOI: 10.1182/bloodadvances.2017015511
应用二：使用Label IT®技术，聚焦于免疫系统研究
Label IT® 核酸标记技术可用于一种新型疫苗注射方法–微针阵列(microneedle array, MNA)的表征研究。传统的疫苗注射方法是通过 3 厘米以上长度的针头进行皮下注射，而微针阵列则是由微米级针头所组成(示意图如下)，以无痛的方式细微的的穿透皮肤，进入到富含免疫细胞群，可减少患者的不适感。
为了提高疫苗的效力(efficacy)，通常会将免疫刺激分子或 “激动剂(agonists) “与疫苗的靶标或抗原一同加入疫苗制剂中。Edwards 等人的研究表明，双链 polyIC RNA 和单链 CpG DNA 寡核苷酸可作为微阵列中的激动剂(agonists)。并且，研究者们认为带负电荷的核酸激动剂(agonists)和带正电荷的抗原之间的静电相互作用，帮助了微阵列的组装。通过使用 Label IT® Cy®3 和 Cy®5 ，分别针对以上两种核酸类型进行荧光标记，方便用于查看标记核酸在微针上的分布，这样就允许了研究者们按照所需要的特定比例，将两种激动剂均一的加入到微阵中，从而使得精确的调整微针阵列 MNA 疫苗的免疫反应成为可能。
发表文章信息：
标题: Tuning innate immune function using microneedles containing multiple classes of toll-like receptor agonists
作者: Camilla Edwards, Robert Oakes et al.
杂志: Nanoscale, Volume 15, Apr 2023.
DOI: 10.1039/D3NR00333G
Label IT®试剂盒共有以下四种形式可供选择，以应对研究人员核酸标记实验的不同应用场景需求：
- Label IT® Nucleic Acid Labeling Kits
- Label IT®Tracker™ Intracellular Nucleic Acid Localization Kits
- Label IT® siRNA Tracker™ Intracellular Localization Kits
- Label IT® Nucleic Acid Modifying Kits
下表总结了不同种类Label IT®试剂盒区别：
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Label IT® Nucleic Acid Labeling
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Label IT® Tracker™
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Label IT® siRNA Tracker™
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Label IT® Nucleic Acid Labeling Modifying
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应用
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in vitro & in vivo应用的多种类型核酸标记
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in vitro & in vivo质粒追踪实验
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in vitro & in vivo siRNA追踪实验
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DNA氨基修饰
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试剂盒组分
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Label IT® Reagent Reconstitution Solution
10X Labeling Buffer
Reagent D1& Buffer N1
G50 Microspin Columns
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Label IT® Reagent Reconstitution Solution
10X Labeling Buffer
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Label IT® Reagent Reconstitution Solution
10X Labeling Buffer
siRNA Dilution Buffer
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Label IT® Reagent Reconstitution Solution
10X Labeling Buffer
Reagent D1& Buffer N1
G50 Microspin Columns
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Label IT® : 核酸比例
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1 µl : 1 µg
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0.5 µl : 1 µg
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1 µl : 1 µg
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0.5 µl : 1 µg
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标记密度
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每20-60 bp 1个标记
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每60-140 bp 1个标记
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每15–40 bp 1个标记
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每20-60 bp 1个标记
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标记物类型
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Cy®3
Cy®5
荧光素
CX-罗丹明
TM-罗丹明
生物素
MFP488
地高辛
DNP
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Cy®3
Cy®5
荧光素
CX-罗丹明
TM-罗丹明
生物素
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Cy®3
Cy®5
荧光素
CX-罗丹明
TM-罗丹明
生物素
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氨基
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试剂盒规格
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25 µl
100 µl
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50 µl
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50 µl
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25 µl
100 µl
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- Label IT® 核酸标记试剂盒–实验优化之核酸标记密度
理想的密度取决于被标记的核酸类型及下游应用。在需要直接追踪核酸的实验中，更适合较高的核酸标记密度；而在想要维持/完整的还原标记核酸的生物学功能的实验中，则更加适合较低的标记密度。使用 Label IT® 核酸标记技术，可以轻松调整到理想的标记密度。
Label IT® 试剂与核酸的比例(v:w)的改变与标记密度呈线性相关性(图 4)。例如，按照说明的初次实验建议，需加入 5 µl Label IT® 试剂标记 5 µg DNA，此时v:w比例为1:1。在保证孵育时间和 DNA 量不变的条件下，如将 Label IT® 试剂的量降低为 2.5 µl 或 增加到10 µl，标记密度将分别降低一半或增加一倍。
实验Tips：使用过高的 Label IT® 试剂量（超过建议量的 4 倍），可能会导致核酸裂解或引起 Label IT® 荧光基团淬灭。
核酸标记密度与所使用的 Label IT® 试剂量及反应的孵育时间呈正线性相关。可通过调整反应中 Label IT® 试剂的用量或反应的孵育时间 (孵育温度仍为37℃)，可轻松灵活的调整到所需要的理想标记密度。
图4. 核酸标记密度与Label IT®试剂用量和反应孵育时间成正比
实验Tips：如何计算核酸标记密度，详细实验步骤及方法请见“Calculate Nucleic Acid Labeling Density”。
Mirus Bio公司介绍
Mirus成立于1995年，始终秉承着为基因递转提供最佳方法及最高效的工具。凭借超过 25 年转染领域的深根细作，获得了多项技术突破，已成为核酸递送领域的全球领导者和值得信赖的品牌。Mirus科学家团队不断突破转染技术的极限，推出了VirusGEN®转染试剂与RevIT™增强剂，进一步提升AAV/Lv产量，助力推动生物治疗药物的降本增效，为CGT领域客户赋能。
上海金畔生物科技有限公司是Mirus中国区总代理，始终秉承着专业、严谨的态度为客户提供优质的产品与服务，Mirus热销转染产品常备现货。如果您对上述产品感兴趣，欢迎致电上海金畔客服热线021-50837765或登录网站www.jinpanbio.cn了解更多产品信息。
