钙离子荧光探针Rhod-5N

        钙离子荧光探针Rhod-5N,三钾盐是美国AAT Bioquest生产的用于标记钙离子的荧光探针，钙的测量对于许多生物学研究至关重要。荧光探针显示结合Ca²⁺后的光谱响应，使研究人员能够通过荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪研究细胞内游离Ca²⁺浓度的变化。Rhod-5N对Ca²⁺的结合亲和力（Kd =~320μM）低于任何其他基于BAPTA的指示剂，并且适用于10μM至1mM的Ca²⁺测量。与Rhod-2指示剂一样，Rhod-5N在不存在二价阳离子的情况下基本上是非荧光的，并且表现出强烈的荧光增强，在结合Ca²⁺时没有光谱移位。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供上等的钙离子荧光探针。

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产品说明书

使用钙指示剂AM酯类

1.使用钙指示剂AM Esters加载细胞：

        AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）重新配制。DMSO储备溶液应在-20°C下干燥储存并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯原液。

b）在实验当天，将钙指示剂溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。使用0.04％Pluronic®F-127在您选择的缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）中制备2至20μM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的*终浓度为4-5 uM。细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用可产生足够信号强度的*小探针浓度。

注意：非离子洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加钙指示剂AM 酯的水溶性。 

c）如果您的细胞（如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，可以将丙磺舒（2-5 mM）或磺吡酮（0.2-0.5 mM）添加到染料工作溶液中（*终浓度为1）对于丙磺舒而言为-2.5mM，对于磺胺吡喃酮为0.1-0.25mM，以减少脱酯化指示剂的泄漏。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）加入细胞板中。

e）将染料加载板室在温度或37℃下孵育20分钟（特别是Fluo-8AM）至2小时，然后将板在室温下再孵育30分钟。

注1：降低加载温度可能会减少指示符的划分。

注2：孵育Cal-520 AM超过2小时可以为某些细胞系提供更好的信号强度。

f）用HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如1mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

g）在所需的Ex / Em波长下进行实验。

2.测量细胞内钙响应：

图1. 没有丙磺舒的CHO-M1细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-M1细胞以每100μL/孔40,000个细胞接种过夜。将100μl的4μMFluo -3AM，Fluo- 4AM 或Cal202®AM在HHBS中加入孔中，并将细胞在37℃下孵育2小时。用100μlHHBS替换染料加载培养基，加入50μl300μMATP，然后使用FITC通道用荧光显微镜（Olympus IX71）成像。

图2. 用Cal-520 或Fluo-4 AM 测量的CHO-K1细胞中ATP刺激的内源性P2Y受体的钙响应。在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-K1细胞以每100μL /孔50,000个细胞接种过夜。100μL的5 μ 中号的Fluo-4 AM或校准- 520® AM与（A）或不具有（B）2.5mM丙磺舒加入到细胞中，并将细胞在37下温育^ø下进行2小时。 通过FlexStation（Molecular Devices）添加ATP（50μL/孔）以达到*终指示的浓度。

使用钙指示剂盐

为了确定溶液的游离钙浓度或 单波长钙指示剂的K _d，使用以下等式：

[Ca] _自由 = K _d [F – F _min ] / F _max – F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，F _min 是不存在钙时的荧光，F _max是钙饱和探针的荧光。解离常数（K _d）是探针对钙的亲和力的量度。与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca ²⁺结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位校准通常产生显着高于体外测定的K _d值。 通过将加载的细胞暴露于受控的Ca来进行原位校准 在离子载体存在下的²⁺缓冲液，例如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素。或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露 于细胞外培养基的受控Ca ²⁺水平。表1列出了一些钙试剂的K _d值供您参考。

使用钙指示剂结合物

        与游离离子指示剂相比，这些相同指示剂的葡聚糖缀合物表现出减少的区室化和低得多的染料渗漏率。由于葡聚糖的分子量，净电荷，标记程度和染料的性质可能影响实验，因此建议研究人员查阅主要文献以获得更多实验信息。