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- 产品名称：NADPH检测试剂盒
- 产品货号：250Tests
- 产品品牌：细胞增殖与活性检测试剂盒
简单介绍
NADPH检测试剂盒
产品描述
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光是AAT Bioquest研发的检测NADP+/NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。
现有的NADP / NADPH测定通过吸收在UV范围内进行。该测定具有低灵敏度和高干扰。这种Amplite™荧光总NADP和NADPH检测试剂盒为敏感检测NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH，其显着提高了检测灵敏度。此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显著降低了生物样品的干扰。无需从样品混合物中纯化NADP / NADPH。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供*上等的Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒。
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Amplite™荧光总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析，可在100μL分析体积（10 nM;图1）中检测少至1皮摩尔的NADP（H）。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。 其信号可通过Ex / Em = 540/590 nm的荧光酶标仪或~576 nm的吸光度酶标仪轻松读取。红色发射时间越长，生物样品的自发荧光干扰越小。
适用仪器
| 光吸收酶标仪 | |
| 吸收： | 576 ± 5 nm |
| 推荐孔板： | 透明底板 |
产品说明书
96孔板测定示例
概述
准备NADP / NADPH反应混合物（50μL）
加入NADPH标准品或测试样品（50μL）
在室温下孵育15分钟–2小时
监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度
注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作方法
1.准备NADPH原液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。
注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.制备NADP / NADPH反应混合物：
将10mL NADP / NADPH传感器缓冲液（组分B）加入NADP / NADPH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。
注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至10μM）：
3.1将10μLNADPH储备溶液（来自步骤1）加入990L PBS缓冲液中以产生10M（10pmol / L）NADPH标准溶液。
注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
3.2取200μL10μMNADPH标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM连续稀释液。
3.3如表1和2中所述，将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。
注意：根据需要准备细胞或组织样本。
表1.实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局
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BL |
BL |
TS |
TS |
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NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
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NS2 |
NS2 |
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NS3 |
NS3 |
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NS4 |
NS4 |
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NS5 |
NS5 |
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NS6 |
NS6 |
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NS7 |
NS7 |
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注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。
表2.每个孔的试剂组成
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NADPH Standard |
Blank Control |
Test Sample |
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Serial Dilutions*: 50 μL |
PBS: 50 μL |
50 μL |
注意：将连续稀释的NADPH标准品从0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADPH（例如，>100μM，*终浓度）可能由于NADPH传感器（对非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。
4.在上清液中运行NADP / NADPH测定：
4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔
注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（*佳540 / 590nm）下用荧光板读数器监测荧光增加。
注意1：也可将板的内容物转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。
注意2：对于NADP / NADPH比率测量，建议使用Cat#15264。
注意3：对于基于细胞的NADP / NADPH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（Cat#20012）裂解细胞。
数据分析
空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从NADPH反应孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。
注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。
图1.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech），在黑色96孔板中用Amplite™荧光总NADP和NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。在孵育30分钟（n = 3）时可以检测到低至10nM（1pmol /孔）的NADPH，而NADH没有响应。