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胞内钙掩蔽试剂—BAPTA-AM

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胞内钙掩蔽试剂—BAPTA-AM 
 
产品编号： B018  CAS号：  
分子式：   分子量：  
EINECS编号：  
BAPTA是一种钙选择性螯合剂。它基本的螯合单位和EDTA类似，只是两个脂肪氮被芳香氮所替代。因此，BAPTA在生理pH下不会被质子化。BAPTA的pKa3为5.47，pKa4为6.36。这个特点显示了去质子化的步骤并不包含在Ca的螯合步骤中。由于不受质子的干扰，它的螯合率比EGTA要高很多。BAPTA-AM是BAPTA的乙酰甲酯衍生物，通过AM法，能被轻易负载到细胞中。BAPTA-AM对于细胞内钙离子的监控是非常有用的。

(1) 溶解方法

·配制50 mM stock solution

  例1) 使用100μl DMSO时,(BAPTA-AM的分子量=764.68)

     　50 mmol／L = (X g／764.68) mol／100 × 10-6 L

X g／764.68 = 50 × 10-7 mol

              X =0.003823 g = 3.82 mg

  例2) 使用20mg BAPTA-AM时,

     　50 mmol／L = (20 mg／764.68) mol／X L

         　     X =0.00002615 ÷ 0.05 = 523μl

  例3) 使用5mg BAPTA-AM时,

     　50 mmol／L = (5 mg／764.68) mol／X L

        　      X =0.000006538 ÷ 0.05 = 130μl

例4) 使用25mg BAPTA-AM时,

     　50 mmol／L = (25 mg／764.68) mol／X L

             　 X =0.00003269 ÷ 0.05 = 654μl

　*保存stock solution的方法和保存时间

   由于AM体遇水容易分解。所以我们推荐现配现用。

   使用无水DMSO,再冷冻的条件下,可以保存约1-2个月。

 

 

(2) 使用方法

 ·稀释stock solution,添加细胞。

   稀释浓度:少的 6 – 8 μM , 多的50 μM

    例1) 8 μM, 使用10μl 50 mM BAPTA-AM stock solution

     　　8 μM = 50 mM ×10μl / Xμl

        　 X = 62,500μl = 62.5 ml

    例2) 50 μM, 使用10μl 50 mM BAPTA-AM stock solution

     　　50 μM = 50 mM ×10μl / Xμl

        　　 X = 10,000μl = 10.0 ml

   *关于细胞的量,不同的细胞使用不同的细胞量。

    一般来说,和Fura2-AM,Fluo3-AM一样的量。

论文里面有如下的条件。请参考。

   例1) 1.75×10-4 cells/cm2, 25 μM BAPTA-AM

 ·培养

   培养时间:20 – 60 分钟

 

钙离子指示剂BAPTA,四钠盐 货号：21004-AAT Bioquest荧光染料

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上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品，欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。

  • 产品名称：钙离子指示剂BAPTA,四钠盐
  • 产品货号：21004
  • 产品品牌：AAT Bioquest

简单介绍

钙离子指示剂BAPTA,四钠盐

产品描述

钙离子指示剂BAPTA,四钠盐

钙离子指示剂BAPTA,四钠盐 货号：21004

货号 21004 存储条件                f/l
规格                       100 mg                                   
Ex (nm) Em (nm)
分子量 564.36 溶剂 Water
产品详细介绍

      BAPTA是一种水溶性且细胞不可渗透的钙螯合剂。它对钙具有高选择性。BAPTA是钙特异性的氨基聚羧酸。四个羧酸官能团的存在使得两个钙离子的结合成为可能。羧酸盐配体的广泛柔韧性对于钙和其他金属离子的配位至关重要。

产品说明书

钙指示剂AM Esters的使用

1.带有钙指示剂AM酯：

      AM酯是非极性酯，很容易穿过活细胞膜，并被活细胞内的细胞酯酶迅速水解。AM酯被广泛用于无创地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须特别注意，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）进行重构。DMSO储备溶液应在-20°C的干燥环境中保存，并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该协议仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯储备溶液。

b）在实验当天，将固体的钙指示剂溶解在DMSO中，或将等分的指示剂储备溶液解冻至室温。在您选择的含0.04％Pluronic®F-127的缓冲液（例如Hanks and Hepes缓冲液）中，准备2至20 µM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的终浓度为4-5 uM。必须根据经验确定细胞加载所需指示剂的确切浓度。为避免因过载和潜在的染料毒性而导致的任何伪影，建议使用可以产生足够信号强度的*小探针浓度。

c）如果您的细胞（例如CHO细胞）中含有有机阴离子转运蛋白，则可以将丙磺舒（2–5 mM）或亚砜吡嗪（0.2–0.5 mM）添加到染料工作溶液中（*终孔浓度为1）丙磺舒为-2.5 mM，亚磺酰吡嗪为0.1 -0.25 mM，以减少去酯化指示剂的泄漏。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）添加到细胞板中。

e）在温度或37°C下将染料加载板室孵育20分钟（尤其是Fluo-8 AM）至2小时，然后在室温下将板孵育30分钟。

注1：降低加载温度可能会减少指示器的分隔。

注2：将Cal-520 AM孵育2小时以上，对于某些细胞系会产生更好的信号强度。

f） 用HHBS或您选择的缓冲液（包含阴离子转运蛋白抑制剂，如1 mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以除去过量的探针。

g）在所需的Ex / Em波长下运行实验。

2.测量细胞内钙响应：

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。

        解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca2+缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca2+水平。

钙离子指示剂BAPTA,四钾盐 货号：21003-AAT Bioquest荧光染料

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  • 产品名称：钙离子指示剂BAPTA,四钾盐
  • 产品货号：21003
  • 产品品牌：AAT Bioquest

简单介绍

钙离子指示剂BAPTA,四钾盐

产品描述

钙离子指示剂BAPTA,四钾盐

钙离子指示剂BAPTA,四钾盐 货号：21003

货号 21003 存储条件 f/l
规格                         100 mg                     价格               
Ex (nm) Em (nm)                  
分子量 628.79 溶剂 Water
产品详细介绍

      BAPTA是一种水溶性且细胞不可渗透的钙螯合剂。它对钙具有高选择性。BAPTA是钙特异性的氨基聚羧酸。四个羧酸官能团的存在使得两个钙离子的结合成为可能。羧酸盐配体的广泛柔韧性对于钙和其他金属离子的配位至关重要。

产品说明书

钙指示剂AM Esters的使用

1.带有钙指示剂AM酯：

      AM酯是非极性酯，很容易穿过活细胞膜，并被活细胞内的细胞酯酶迅速水解。AM酯被广泛用于无创地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须特别注意，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）进行重构。DMSO储备溶液应在-20°C的干燥环境中保存，并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该协议仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯储备溶液。

b）在实验当天，将固体的钙指示剂溶解在DMSO中，或将等分的指示剂储备溶液解冻至室温。在您选择的含0.04％Pluronic®F-127的缓冲液（例如Hanks and Hepes缓冲液）中，准备2至20 µM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的终浓度为4-5 uM。必须根据经验确定细胞加载所需指示剂的确切浓度。为避免因过载和潜在的染料毒性而导致的任何伪影，建议使用可以产生足够信号强度的*小探针浓度。

c）如果您的细胞（例如CHO细胞）中含有有机阴离子转运蛋白，则可以将丙磺舒（2–5 mM）或亚砜吡嗪（0.2–0.5 mM）添加到染料工作溶液中（*终孔浓度为1）丙磺舒为-2.5 mM，亚磺酰吡嗪为0.1 -0.25 mM，以减少去酯化指示剂的泄漏。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）添加到细胞板中。

e）在温度或37°C下将染料加载板室孵育20分钟（尤其是Fluo-8 AM）至2小时，然后在室温下将板孵育30分钟。

注1：降低加载温度可能会减少指示器的分隔。

注2：将Cal-520 AM孵育2小时以上，对于某些细胞系会产生更好的信号强度。

f） 用HHBS或您选择的缓冲液（包含阴离子转运蛋白抑制剂，如1 mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以除去过量的探针。

g）在所需的Ex / Em波长下运行实验。

2.测量细胞内钙响应：

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。

        解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca2+缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca2+水平。